グラム 染色 方法。 染色法|細菌の検査 各論|神奈川県衛生研究所

グラム染色法とは

グラム 染色 方法

概要 [ ] グラム染色によって細菌類は大きく2種類に大別される。 染色によって紫色に染まるものを 、紫色に染まらず赤く見えるものを という。 この染色性の違いはの構造の違いによる。 グラム陽性はが厚く、グラム陰性はペプチドグリカン層が薄く、さらにを有する。 そしてこの細胞壁の構造の違いは、この両者が生物学的に大きく違うことを反映しており、グラム染色は細菌を分類する上で重要な手法になっている。 は、その外膜がや粘液層で覆われた構造となっているものが多く、例外はあるものの、一般的な傾向としては相対的に病原性が高い。 このような構造は細菌細胞の抗原を隠しカモフラージュするように働く。 人間の免疫系は異物を抗原により認識するから、抗原が隠されると、侵入してきたものを人体が探知するのが難しくなる。 莢膜の存在はしばしば病原菌の毒性を高める。 さらに、グラム陰性菌は外膜にリポ多糖類であるを持っているが、これが炎症を悪化させ、ひどい場合には敗血症性ショックを引き起こすこともある。 は一般的には相対的にそれほど危険ではない。 これは人体がペプチドグリカンを持たず、従ってグラム陽性菌のペプチドグリカン層にダメージを与える酵素を作る能力を持っているからである。 また、グラム陽性菌はなどのに対する感受性が高いことが多い。 なお、こういった傾向に対する例外としてはやなどの・などが知られている。 を使って細菌の形態を観察することは、細菌を同定するための第一歩である。 しかし、に塗抹した細菌をそのまま観察しても細菌以外のものとの見分けが付きにくいため、通常は染色を施すことが多い。 グラム染色は二種類の色素を使って染め分ける点では、一種類の色素によるもの(単染色)より複雑な染色法であるが、その操作自体は比較的容易であり、しかも細菌の大きさ、形状、配列に加えて、グラム染色性(=細胞壁構造の違い)の情報まで得られる。 このため、細菌の鑑別の際にはまず最初に必ず行われる基本的な同定法である。 基本的な方法 [ ]• きれいなに、新しく分離培養した菌を含む菌液を、などで薄く曇る程度に塗抹し、乾燥後、の火炎中を2-3回通過させて固定する。 古い培養液では、グラム陽性菌であっても死んでしまっていて染まらない場合があるため、必ず新しく分離培養したものを用いる。 またはなどの塩基性の紫色色素液で1分程度染色する。 この段階では、菌はグラム陽性と陰性に関わらず紫色に染まる。 この処理で色素が不溶化される。 1分間水洗した後、過剰の水分を除く。 この段階でグラム陰性菌だけが脱色される。 ただちに水洗し、風乾する。 またはなどの赤色色素で1分程度染色する(対比染色)。 この処理で両方の菌は赤染されるが、グラム陽性菌は先に染めた紫色が残っているため変化はない。 乾燥後、で観察する。 は濃紫色、は赤色に染まって見える。 グラム染色で失敗する場合、その多くはエタノールによる脱色の過剰で、この場合グラム陽性菌が陰性に見えてしまう。 こうした判定のミスを予防するために、操作に慣れるまでは対照となる検体(例えばグラム陰性の対照に、グラム陽性の対照に)を同じスライドグラス上で一緒に染色して、染まり方を確認するのが薦められる。 後染色はサフラニンによる方法(Huckerの変法)が標準的であるが、サフラニンは一部の細菌の染色態度が良くないので、臨床診断で用いる場合には、可能ならばフクシンを用いることが推奨されている。 ベッドサイドや臨床検査部などではヨウ素処理と脱色を一つの液にまとめ、サフラニンをフクシンに代えた迅速法(商品名 フェイバーGなど)が用いられることが多い。 この場合、媒染脱色液はエタノールと同じ扱いになる。 染色態度はHuckerの変法に劣らず、かかる時間は短い。 染色原理 [ ] 真正細菌の細胞壁 これまでグラム染色性の違いは、細菌の細胞壁の構造によると考えられてきた。 グラム陽性菌の細胞壁が、一層の厚い層から構成されているのに対し、グラム陰性菌では、何層かの薄いペプチドグリカン層の外側を、と呼ばれる、(リポポリサッカライド LPS)を含んだが覆う形となっている。 このため、アルコールなどで処理すると、グラム陰性菌の外膜は容易に壊れ、また内部のペプチドグリカン層が薄いために、細胞質内部の不溶化した色素が容易に漏出して脱色される。 グラム陽性菌ではこの漏出が少なく、脱色されないまま色素が残る。 2015年にMichael J. Wilhelmらは、染色に用いられるクリスタルバイオレットは細胞質内部まで浸透出来ず、大部分がペプチドグリカン層にトラップされると説明している。 グラム陽性菌ではペプチドグリカン層が厚いため色素の漏出が少ないが、グラム陰性菌はペプチドグリカン層が薄く、エタノール洗浄で容易に色素が漏出、脱色しうる。 これは長い間考えられてきたグラム染色の原理に一石を投じるものであり、注目に値する。 なお、元から細胞壁を持たないやはグラム陰性である。 また、抗酸菌はグラム不定性を示すが、これは抗酸菌の細胞壁にと呼ばれる性の脂質が多く含まれているため、水溶性色素の浸透が悪いためである。 また、を作る菌では、芽胞の部分は染色されず透明に見える。 グラム染色性による分類 [ ] 代表的な細菌について、グラム染色の結果を示すと以下のようになる。 属(ブドウの房状に配列する。 、などが含まれる)• 属(直鎖状に配列、双球菌、4連、8連球菌など。 、などが含まれる)• 芽胞を作る菌:(、など)と(、など)• (など)• (、)• (ニキビの原因となるなど)• (など)• (など)• (など)• (、、、、など)• (ただし、レジオネラはグラム染色では染色性が良くないので、微生物学的な同定にはを用いる。 (など)• らせん状桿菌• (状形態をとる:、など)• 、など• リケッチア、クラミジアはにを欠く。 マイコプラズマはそのものを持たないため、染まらない。 グラム不定性• (分類上は放線菌に近くグラム陽性:、など) なお、グラム染色法自体は真正細菌以外の細胞にも行うことが可能であり、その場合、の有無によって染色性が決まる。 動物細胞はグラム陰性に、細胞や細胞はグラム陽性に染まる。 一般的なは、と呼ばれる細胞壁を持つがグラム陰性である。 その他、一部のを持つ古細菌(、など)や、大型の(ミミウイルス)もグラム陽性に染まる。 しかしながら、これらは真正細菌の細胞壁合成を阻害するなどのに対し非感受性である。 脚注 [ ] [] ウィキメディア・コモンズには、 に関連するカテゴリがあります。

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グラム染色

グラム 染色 方法

染色法 (微生物部) 1.グラム染色法 (1)グラム染色法(Hucker変法など)• 細菌を色素によって染め分ける方法の一つで、細菌分類学の基礎になる重要な染色法である。 デンマークの学者ハンス・グラム(Hans G. Gram)によって1884年に考案された。 細菌はグラム染色によって2種類に大別できる。 グラム陽性 : ゲンチアナ紫やクリスタル紫で染色され、媒染剤(ルゴール等)によりレーキを形成し、これはアルコール等の脱色液でも脱色されない。 グラム陰性 : グラム陽性物質がないため、アルコール等で色が抜け落ちて顕微鏡で確認できないことから、サフラニンやフクシン等の赤い色素で染めた(後染色、対比染色)もの。 染色性の違いは細胞壁の構造の違いによる。 グラム陽性菌と陰性菌の間に見られる細胞壁の大きな違いはこの両者が生物学的に大きく違うことを反映している。 3%KOHを用いたグラム鑑別• スライドグラス上に少量の3%KOHをとり、被検菌を混和し、変化がなければグラム陽性、糸を引けば陰性(新鮮な試薬と新鮮培養菌を使用)である。 グラム陽性菌は至適培養時間を経過すると、徐々に陰性の色調を呈するので注意する。 (バシラス属、クロストリジウム属は 培養後、数時間から陰性の色調になる場合がある) <グラム染色と形態> 2.その他の染色法 (1)単染色 一種類の染色液で染める方法• レフレルのアルカリ性メチレンブルー 薄いブルー 一般に細菌細胞と細胞の核を濃く染めるが、細胞質は薄く染める。 膿や喀痰からの細菌検出に用いられることが多い。 パイフェル液 赤色 チールの石炭酸フクシン液を5-10倍に薄めた液である。 細胞質も濃く染めるため菌の形を見るのに適している。 グラム染色で染まりにくいレジオネラやカンピロバクターの形を観察するにはパイフェル液が適している。 (チールの石炭酸フクシン液は、結核菌の染色に用いられる) (2)鞭毛染色 特殊染色法• 運動性の器官である鞭毛は、その位置や数が分類に重要な場合がある。 鞭毛は非常に細い器官であり、本来は電子顕微鏡で観察する。 特殊な方法で鞭毛を太くして染め出し、光学顕微鏡で観察が可能になる。 鞭毛にタンニン酸を付着して太くし、それを染めることで、光学顕微鏡で観察することが可能になった。 染色液の取り扱いや染色手技が難しく、また鞭毛の発育状態も大きく影響する。 レイフソン法が有名であるが、このほかに、劉 Ryu の方法があり、より取り扱いが容易になっている。 | | |.

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グラム 染色 方法

グラム染色とは、体組織内のを速やかに識別するために用いられる検査方法のことです。 サンプル内の細菌はその細胞壁の化学的・形質的特徴の違いによって、グラム陽性とグラム陰性に区別されます。 X 出典文献 Bergey, David H. ; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H. Sneath 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th ed. 多くの医療現場で、グラム染色は細菌感染の診断の最初の段階として行われます。 グラム染色は、デンマークの科学者ハンズ・クリスチャン・グラム(1853-1938)によって、1882年に考案され、1884年に研究論文として発表されました。 肺炎双球菌(肺炎連鎖球菌)と肺炎桿菌という似通った症状を引き起こす2種類の病原菌を識別するためにグラム教授によって考案されたこの染色法は、その後洗練を重ね、細菌の分類や細菌感染の診断に欠かせないテクニックとして今日に至っています。 X 出典文献 Gram, HC 1884. Fortschritte der Medizin 2: 185—9. スライドグラスにサンプルを付着させます(塗抹作業)。 グラム染色は医療用検体の中の細菌を特定するために用いる他、シャーレの中で培養された細菌を観察するために用いることもできます。 グラム染色を効果的に行うには、サンプルを薄い膜にして染料の上に塗り付けます。 抽出して24時間以内のサンプルが良いでしょう。 細菌は古くなると細胞壁が壊れやすくなり、グラム染色をする際にしっかりと染料を付着させることができなくなります。 X 出典文献• 体組織のサンプルを使う場合は、サンプルを1~2滴スライドグラスに落とします。 そして、もう一枚の消毒されたスライドグラスの角を使ってサンプルを塗り広げ、薄い塗抹標本を作ります。 次の作業に移る前に、標本を空気乾燥させます。 シャーレから細菌を移す場合は、まず白金耳(微生物を移植するための先がループ状になった針金)をブンセンバーナーで真っ赤になるまで炙って消毒します。 しばらくそのままにして冷まします。 つぎに、白金耳を使って殺菌された水を一滴スライドグラスに落とします。 もう一度白金耳を消毒して冷まします。 そして、白金耳を使って細菌のサンプルを少量水の上に落とし、優しくかき混ぜていきます。 X 出典文献• 培養液の中の細菌はボルテックスミキサーでかき混ぜた後、上記の白金耳を使ってスライドグラスに移植します。 この場合、水を加える必要はありません。 X 出典文献• サンプルを綿棒に付着させて移植する場合は、綿棒を軽く回しながらスライドグラスに塗り付けていきます。 X 出典文献 準備した標本を加熱します。 標本を加熱することでスライドグラスに固定し、染色の際に流れにくくします。 ブンセンバーナーに火を点け、スライドグラスを2、3度炎の中に通します。 あるいは、電動加熱気の上に置いて温めても良いでしょう。 加熱しすぎないように注意してください。 サンプルの組織が変形する危険があります。 ブンセンバーナーを使う場合は、炎が背の高いオレンジ色ではなく、青色の小さい円錐型になるように調整しましょう。 X 出典文献• バーナーの代わりに、メチルアルコールを使って固定するという方法もあります。 乾いた標本の上にメチルアルコールを1、2滴垂らし、余分な液体を取り除いた後、空気乾燥させます。 この方法を使えば、細菌が感染した細胞(宿主細胞)を破壊する危険を最小限にすることができ、なおかつ顕微鏡で覗いた際に背景がよりきれいに映るという利点もあります。 脱色液を加え、速やかに洗い流します。 脱色液は通常アセトンとエタノールを1:1の割合で混ぜて作ります。 脱色はタイミングが重要になり、グラム染色において最も神経を使う作業といえます。 スライドグラスを傾け、紫色が見えなくなるまで脱色液を注いでいきます。 作業時間は10秒以内で、特に脱色液のアセトンの割合が多い場合はさらに短い時間で作業を終わらせる必要があります。 紫色が見えなくなった時点で直ちに作業をやめましょう。 脱色液をかけ過ぎると、グラム陰性細胞だけでなくグラム陽性細胞からもクリスタルバイオレットの色素が流出してしまいます。 そうなるとまた最初から染色作業をやり直すことになります。 脱色した後は、速やかに上記の要領で余分な脱色液を洗い流しましょう。 X 出典文献 ただし、アセトンの含有量が多いほど脱色にかかる時間は短くなり、より正確なタイミングが必要になります。 タイミングが難しい場合は、脱色液を一滴ずつ加えてみましょう。 X 出典文献 標本に対比染色液(後染色液とも)を加えます。 対比染色液はサフラニンまたはフクシンからできていて、脱色されたグラム陰性細胞を持つ細菌を赤色またはピンク色に染めることで、グラム陰性とグラム陽性の細菌を色分けすることができます。 X 出典文献 Beveridge TJ, Davies JA November 1983. "Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain". Journal of bacteriology 156 2 : 846—58. X 出典文献 Davies JA, Anderson GK, Beveridge TJ, Clark HC November 1983. "Chemical mechanism of the Gram stain and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy which replaces the iodine mordant of the stain". Journal of bacteriology 156 2 : 837—45. そのまま、少なくとも45秒ほど置いた後、洗い流します。 X 出典文献• フクシンは ヘモフィリス菌属 や レジオネラ菌属など多くのグラム陰性の細菌をさらに強く染色することができます。 X 出典文献 初心者が扱うには最適な染色液といえるでしょう。. 光学顕微鏡を用意します。 スライドグラスを光学顕微鏡にセットします。 細菌はそれぞれサイズが大きく異なりますから、顕微鏡の倍率は400x~1000xまで幅広く調整することになります。 「液浸油」を一滴スライドグラスに落とします。 この際、大きな動作によって油が泡立たないように注意してください。 X 出典文献 顕微鏡の調節ネジを回しながら、対物レンズが油に触れる位置に来るように調整します。 液浸油は特殊なレンズにのみ使うことができます。 通常のドライレンズに使うことはできません。 グラム陽性とグラム陰性の細菌を判別しましょう。 光学顕微鏡下でスライドグラスを観察します。 グラム陽性の細菌は、クリスタルバイオレットが分厚い細胞壁の内側に閉じ込められているため、紫色をしています。 一方、グラム陰性の細菌は、ピンク色または赤色をしているはずです。 これは脱色作業の際にクリスタルバイオレットがその薄い細胞壁からすべて流出し、代わってピンク色の対比染色液が入り込んだためです。 サンプルが分厚すぎる場合は、誤った陽性結果を示すことがあります。 もしすべての細菌がグラム陽性反応を示している場合は、新しいサンプルを使ってもう一度染色をやり直し、染色結果が正確かどうか確かめてください。 脱色液を注ぎ過ぎた場合は、誤った陰性結果を示すことがあります。 新しいサンプルを染色し、実験結果を再確認しましょう。 不定性細菌を精査しましょう。 時として、細胞質のもろさ、あるいは細胞壁の分厚い脂分によって、正確に染色できない細菌もあります。 不定性細菌の場合、紫色とピンク色の染料が同じ細胞内に混在したり、また時として、同じ標本の別々の細胞内に混在することもあります。 これは抽出してから24時間以上経た細菌によく見られる現象ですが、細菌の種類によってはグラム染色自体が難しいものもあります。 不定性細菌の場合、抗酸染色、培養観察、TSI培地での培養、そして遺伝子検査といったさらに高度な検査が必要になるでしょう。 X 出典文献• 放線菌、アルスロバクター、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、そしてプロピオン酸菌などの菌属はすべてグラム陽性とみなされていますが、往々にして、染色の際にはどちらとも判別しがたい現れ方をします。 X 出典文献• トレポネーマ(梅毒トレポネーマなどを含みます)、クラミジア、リケッチアといった小さく細長い菌属は、適切にグラム染色を施すのがきわめて困難な病原菌です。 X 出典文献• グラム染色の成功は標本の状態如何によって決まります。 被験者には、状態の良いサンプルを提供してもらえるように、しっかり説明しましょう(例えば、痰のサンプルが必要な場合、唾を吐くのと深い咳をするのとでは、どちらが有効か明白でしょう)。 脱色液としては、エタノールはアセトンよりも反応速度が遅くなります。 綿棒で頬の内側からサンプルを取って練習してみましょう。 サンプルにはグラム陽性とグラム陰性の両方の細菌が含まれているはずです。 染色の結果、どちらか一方の特性しか現れなかった場合は、おそらく脱色液の量が不十分であったか、もしくは過剰であったことが考えられます。 X 出典文献• 洗浄や脱色をする際、バネの付いた木製の洗濯バサミを使ってスライドグラスを挟んでも良いでしょう。 X 出典文献• Bergey, David H. ; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H. Sneath 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th ed. Gram, HC 1884. Fortschritte der Medizin 2: 185—9. Beveridge TJ, Davies JA November 1983. "Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain". Journal of bacteriology 156 2 : 846—58. Davies JA, Anderson GK, Beveridge TJ, Clark HC November 1983. "Chemical mechanism of the Gram stain and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy which replaces the iodine mordant of the stain". Journal of bacteriology 156 2 : 837—45. wikihow. wikihow. wikihow. facebook. pinterest. wikihow. wikihow. facebook. pinterest. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow. wikihow.

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